pNaSS 通過(guò)臭氧化和接枝聚合接枝到PCL表面研究

        聚苯乙烯磺酸鈉（pNaSS）通過(guò)臭氧化和接枝聚合接枝到聚（ε-己丙酮）（PCL）表面。研究了臭氧化和聚合時(shí)間以及接枝液中莫爾鹽濃度對(duì)接枝程度的影響。通過(guò)甲苯胺藍(lán)染色確定接枝程度。采用衰減全反射傅里葉變換紅外光譜（ATR-FTIR）、能量色散X射線(xiàn)光譜（EDX）和X射線(xiàn)光電子能譜（XPS）對(duì)表面化學(xué)變化進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，該接枝不會(huì)誘導(dǎo)PCL降解，并且pNaSS作為薄的共價(jià)穩(wěn)定層嫁接到PCL上。此外，改性的PCL表面顯示成纖維細(xì)胞的代謝活性顯著增加，以及更好的細(xì)胞擴(kuò)散和更高的粘附強(qiáng)度。因此，通過(guò)將一層薄薄的pNaSS固定在其表面上，PCL的生物活性大大增強(qiáng)。pNaSS的接枝是一種很有前途的方法，可以提高組織工程應(yīng)用（如韌帶重建）中使用的PCL基材料的生物活性。

1 引言

        組織工程的主要目標(biāo)之一是開(kāi)發(fā)可生物降解的支架，允許細(xì)胞在三維結(jié)構(gòu)中粘附、增殖和分化。如果生物降解性方面通常促使選擇α-羥基聚酯作為支架基質(zhì)：脂肪族聚酯的主要缺點(diǎn)是缺乏促進(jìn)良好細(xì)胞反應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。為了克服聚酯材料遇到的化學(xué)成分問(wèn)題，人們提出了多種改變材料表面的方法：通過(guò)表面處理引入極性基團(tuán)、吸附生物分子和生物活性化合物的共價(jià)固定化[1\u20125]。與生物分子可以快速解吸的吸附方法相比，最后一種方法具有提高生物相容性的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)具有一定的耐久性。然而，有許多因素會(huì)影響生物分子如何拴在表面，從而影響其生物活性[1]。此外，當(dāng)使用糖胺聚糖等生物分子時(shí)，由于其異質(zhì)性，很難理解生物分子對(duì)細(xì)胞增殖的影響。事實(shí)上，分子量、凈電荷和離子基團(tuán)分布的分散性可以顯著影響生物反應(yīng)[1,3]。此外，生物分子固定化的成本和控制仍然是控制細(xì)胞反應(yīng)的關(guān)鍵步驟。因此，引入官能團(tuán)是改變底物的電荷或化學(xué)組成表面的更簡(jiǎn)單方法，因此可以調(diào)節(jié)從細(xì)胞培養(yǎng)血清吸附到底物表面的蛋白質(zhì)的重排[6]。

        通過(guò)陰離子和親水性單體的接枝共聚來(lái)改性聚酯是一種眾所周知的增強(qiáng)體外和體內(nèi)細(xì)胞行為的通用方法。硫酸化大分子或單體已被廣泛用于設(shè)計(jì)具有良好血液相容性和抗凝活性的聚合物生物材料[7]。有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)，將聚苯乙烯磺酸鈉（pNaSS）嫁接到聚乙烯基質(zhì)上導(dǎo)致HeLa S3[8]和中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞[9]的高度粘附。Kishida等[8]認(rèn)為，靠近可電離磺酸鹽基團(tuán)的芳環(huán)的存在允許高蛋白吸附到pNaSS表面。最近，我們的研究小組證明，當(dāng)pNaSS從聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET）基合成韌帶移植時(shí)，pNaSS允許更強(qiáng)的成纖維細(xì)胞粘附，更好的細(xì)胞擴(kuò)散，更均勻的細(xì)胞分布在材料表面，并增加細(xì)胞膠原分泌[10\u201211]。當(dāng)pNaSS從非聚合物生物材料表面接枝時(shí)，觀(guān)察到相同的效果[12\u201215]。事實(shí)上，當(dāng)pNaSS從鈦表面接枝時(shí)，與天然鈦表面相比，蛋白質(zhì)吸附水平增加，吸附的蛋白質(zhì)也受到選擇性調(diào)節(jié)[12]。此外，MG63 [13] 或人間充質(zhì)干細(xì)胞 [14] 的粘附及其在 pNaSS 移植表面上的擴(kuò)散得到增強(qiáng)。此外，在pNaSS接枝表面發(fā)現(xiàn)了更好的堿性磷酸酶ALP活性和礦化，強(qiáng)調(diào)了pNaSS對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響[14]。最后，當(dāng)基于PET的合成韌帶植入綿羊模型進(jìn)行前交叉韌帶重建時(shí)，pNaSS移植增強(qiáng)了韌帶與骨的直接接觸，減少了骨/韌帶界面的纖維瘢痕組織[11,16]。因此，將pNaSS固定在組織工程應(yīng)用中使用的三維支架中，特別是在韌帶重建中，可以有效地調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)，并且似乎是更復(fù)雜生物分子共價(jià)固定的良好替代方案。

        然而，苯乙烯磺酸鈉（NaSS）是一種陰離子乙烯基單體，由于被大水合球包圍的高度電離磺酸基團(tuán)與疏水性聚合物主鏈之間不相容，因此以其較差的聚合動(dòng)力學(xué)而聞名[17]。到目前為止，pNaSS尚未共價(jià)嫁接到基于聚（ε-己內(nèi)酯）（PCL）等合成聚酯的可生物降解支架上，除非我們小組最近的初步研究[18\u201219]。事實(shí)上，由于PCL是一種半結(jié)晶可生物降解聚合物，具有較低的特征溫度（玻璃化轉(zhuǎn)變溫度約為-60°C，熔點(diǎn)溫度在59至64°C之間[20–21]），因此只能在溫和的條件下進(jìn)行接枝，以避免PCL的降解以及熱和機(jī)械性能的劇烈變化。因此，需要開(kāi)發(fā)一種通用策略，允許從PCL中有效接枝pNaSS，同時(shí)保持pNaSS的生物活性和基于PCL的生物材料的內(nèi)在特性。

        本研究研究了NaSS在PCL薄膜上的接枝聚合，研究了在各種反應(yīng)參數(shù)下進(jìn)行的接枝聚合：臭氧化和聚合時(shí)間，以及接枝液中莫爾鹽的濃度。通過(guò)潤(rùn)濕性測(cè)量、衰減全反射傅里葉變換紅外光譜（ATR-FTIR）、能量色散X射線(xiàn)光譜（EDX）和X射線(xiàn)光電子能譜（XPS）證明了pNaSS接枝的證據(jù)。通過(guò)甲苯胺藍(lán)染色確定接枝程度。通過(guò)測(cè)量細(xì)胞代謝活性和形態(tài)的體外測(cè)定評(píng)估了pNaSS接枝對(duì)成纖維細(xì)胞行為的影響。

2 材料與方法

2.1 材料

        PCL是從Sigma-Aldrich獲得的。NaSS （Sigma-Aldrich） 在蒸餾水/乙醇溶液 （10/90 % （v/v）） 中重結(jié)晶純化。使用莫爾鹽、碘化鉀和甲苯胺藍(lán) （BT） （Sigma-Aldrich） 未經(jīng)任何純化。所有溶劑均從Fisher購(gòu)買(mǎi)，并按原樣使用。磷酸鹽緩沖鹽水溶液 （PBS）、Dulbecco 改良鷹培養(yǎng)基 （DMEM）、青霉素-鏈霉素 （PenStrep） 和胎牛血清 （FBS） 由 Gibco 提供。MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑鹽）、鬼筆環(huán)肽-FITC和Hoechst 33258購(gòu)自Sigma。McCoy成纖維細(xì)胞購(gòu)自ATCC（CRL-1696，美國(guó)）。

2.2 PCL薄膜的制備和pNaSS的接枝

        這些薄膜是使用旋涂法制造的。將二氯甲烷（60%（w / v））中的PCL溶液滴入載玻片上，然后使用SPIN150-v3 SPS以1500rpm旋轉(zhuǎn)30秒。將薄膜風(fēng)干2小時(shí)，然后真空干燥24小時(shí)以除去溶劑，最后將它們切成直徑為~15.5mm的小圓盤(pán)。

        對(duì)于pNaSS接枝，將薄膜在室溫下攪拌到蒸餾水中懸浮。臭氧發(fā)生器BMT 802N（ACW）產(chǎn)生臭氧，壓力為0.5 bar，氧氣流速為0.6 L min−1.臭氧化后，將PCL薄膜轉(zhuǎn)移到含有莫爾鹽的蒸餾水（15%（w/v））中的脫氣NaSS溶液中。將系統(tǒng)保持在45°C以允許接枝聚合發(fā)生。聚合后，將樣品用蒸餾水洗滌過(guò)夜，最后真空干燥。薄膜通過(guò)連續(xù)浸泡滅菌和制備，如下所示：在70%乙醇中2小時(shí)，在無(wú)菌PBS溶液中2小時(shí)，在DMEM中1小時(shí)，在完全培養(yǎng)基中1小時(shí)。

2.3 臭氧化和聚合后接枝pNaSS產(chǎn)生的過(guò)氧化物的定量測(cè)定

        PCL薄膜中臭氧化產(chǎn)生的過(guò)氧化物量通過(guò)分光光度法（碘化物法）測(cè)定[22]。將兩片薄膜置于1 mL異丙醇和7 mL含有1 ppm-氯化鐵的碘化鉀溶液中，并在45°C下保持10分鐘。反應(yīng)后，立即使用分光光度計(jì)（Perkin Elmer Lambda 25）測(cè)量溶液在360nm處的吸光度，通過(guò)跟蹤三碘化物陰離子濃度來(lái)測(cè)量氧化碘。該方法通過(guò)使用過(guò)氧化苯甲酰進(jìn)行校準(zhǔn)。過(guò)氧化物的密度以過(guò)氧化物摩爾/厘米表示2PCL薄膜。

通過(guò)BT與pNaSS磺酸基團(tuán)的絡(luò)合，通過(guò)比色法測(cè)定嫁接到PCL薄膜上的pNaSS的量。簡(jiǎn)而言之，將一層薄膜置于5mL BT溶液中，并在30°C下保持6小時(shí)。反應(yīng)后，將絡(luò)合的BT在室溫下在10 mL乙酸溶液（50%（v））中解絡(luò)24小時(shí)。此后，使用分光光度計(jì)（Perkin Elmer Lambda 25）在633nm處測(cè)量溶液的吸光度。該方法通過(guò)使用乙酸中的BT溶液進(jìn)行校準(zhǔn)。接枝密度（GD）以mol of pNaSS / cm表示2PCL薄膜。

2.4 PCL表征

        使用配備折光率檢測(cè)器的 Spectra Physics P100 泵（Wyatt Technology Optilab Rex）使用尺寸排阻色譜 （SEC） 測(cè)定 PCL 數(shù)平均值和重均分子量（分別為 Mn 和 Mw）和多分散指數(shù) （PDI）。針對(duì)每種薄膜條件分析兩個(gè)樣品。將樣品溶解在四氫呋喃中，并通過(guò)2個(gè)混合C-13色譜柱（聚合物實(shí)驗(yàn)室）洗脫，這些色譜柱以1 mL min的流速串聯(lián)連接−1.樣品濃度為 10 mg mL−1并使用一系列窄多分散聚苯乙烯標(biāo)準(zhǔn)品生成常規(guī)校準(zhǔn)。

        差示掃描量熱法 （DSC） 分析在氮?dú)鈿夥障率褂?131 Seratam Instrumentation 量熱儀進(jìn)行。針對(duì)每種薄膜條件分析兩個(gè)樣品。在25至200°C的加熱速率下，以10°C的最小加熱速率掃描樣品一次−1.熔融溫度（Tm）和熔融焓（ΔHm）的PCL是從第一次掃描中確定的;熔化溫度取于峰值的最大值。此后，在−100至25°C的加熱速率下，以10°C的最小加熱速率對(duì)樣品進(jìn)行兩次掃描−1.玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）在第二次掃描的中點(diǎn)確定。結(jié)晶度 （Xc） 使用公式 1 計(jì)算：

2.5 表面分析

接觸角 （θ） 測(cè)量采用無(wú)柄跌落法，使用 Drop Shape Analysis 軟件和 KRUSS 設(shè)備進(jìn)行。使用的液體是蒸餾水，在不同位置對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行 3 次測(cè)量。針對(duì)每種薄膜條件分析兩個(gè)樣品。

傅里葉變換紅外 （FTIR） 光譜以衰減全反射模式 （ATR） 記錄，使用連接到 Thermo Nicolet Avatar 6700 FTIR 并由 OMNIC 軟件控制的 SMART OMNIC 采樣器獲得。光譜是通過(guò)在 650 – 4000 cm 范圍內(nèi)累積 128 次掃描獲得的−1分辨率為 4 cm−1.背景掃描是在沒(méi)有樣品的情況下采集的。

使用環(huán)境掃描電子顯微鏡（ESEM – Hitachi TM3000）進(jìn)行能量色散X射線(xiàn)光譜（EDX）分析，該顯微鏡在15 kV的加速電壓下工作，并配備EDX探頭（Hitachi SwiftED3000）。采集時(shí)間設(shè)置為 196.6 s。針對(duì)每種薄膜條件分析了三個(gè)樣品。

X射線(xiàn)光電子能譜（XPS）分析使用Surface Science Instruments S探針光譜儀進(jìn)行。該儀器具有單色 Al Kα X 射線(xiàn)和低能電子泛光槍?zhuān)糜谥泻头菍?dǎo)電樣品的電荷。起飛角度為55°。Service Physics Hawk Data Analysis 7 軟件用于計(jì)算從測(cè)量和詳細(xì)掃描中獲取的峰面積的表面原子濃度，然后使用適當(dāng)?shù)脑孛舾卸认禂?shù)進(jìn)行校正，以及高分辨率掃描的峰值擬合。通過(guò)將最低結(jié)合能C1s高分辨率峰的結(jié)合能定為285.0 eV來(lái)校準(zhǔn)高分辨率光譜的結(jié)合能尺度。對(duì)于成分分析，分析了每種樣品類(lèi)型的三個(gè)不同斑點(diǎn)。從每個(gè)樣品的一個(gè)點(diǎn)采集高分辨率 C1s 掃描。

2.6 嫁接穩(wěn)定性

為了研究pNaSS接枝的穩(wěn)定性，將滅菌的薄膜浸入無(wú)菌PBS（pH = 7.1）中，并在37°C下在5%CO的加濕氣氛中孵育2在空氣中停留不同的時(shí)間段。在孵育結(jié)束時(shí)，監(jiān)測(cè)PBS的pH值，并將樣品在PBS中洗滌過(guò)夜。通過(guò)BT方法測(cè)定孵育膜上殘留的接枝pNaSS的量，并根據(jù)公式2計(jì)算：

2.7 體外檢測(cè)

滅菌后，將薄膜放置在 24 孔板的單個(gè)孔中，并用 PTFE 環(huán)稱(chēng)重。將McCoy細(xì)胞在37°C下以50,000個(gè)細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度接種到薄膜上2小時(shí)。 隨后，用補(bǔ)充了PenStrep（1%）和FBS（10%）的DMEM淹沒(méi)了PTFE環(huán)上方的油井。培養(yǎng)24小時(shí)后，通過(guò)改良的MTT測(cè)定法測(cè)量細(xì)胞線(xiàn)粒體活性[24]。PBS 中的 MTT 溶液（5 mg mL−1）加入到每個(gè)孔中，然后在37°C下孵育4小時(shí)。 孵育期結(jié)束后，小心地取出薄膜并轉(zhuǎn)移到裝有 500 μL 二氯甲烷的玻璃瓶中。薄膜完全溶解后，加入500μL二甲基亞砜，并將樣品在攪拌下放置過(guò)夜。使用分光光度計(jì)（Perkin Elmer Lambda 25）在550nm處測(cè)量光密度。在沒(méi)有細(xì)胞的培養(yǎng)物中維持的薄膜并如上分析用于背景減法。這些膠片一式三份進(jìn)行了測(cè)試。作為對(duì)照，將McCoy細(xì)胞接種在經(jīng)過(guò)商業(yè)處理的聚苯乙烯培養(yǎng)皿（TCPS）上。

對(duì)于形態(tài)學(xué)研究，所有圖像均在培養(yǎng) 48 小時(shí)后拍攝。ESEM圖像使用Hitachi TM3000 ESEM在15 kV下運(yùn)行，并配備了在4 °C下運(yùn)行的Peltier平臺(tái)。 對(duì)于該實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞密度為 10,000 個(gè)細(xì)胞/孔。對(duì)于熒光圖像，用Hoechst和/或phalloïdin對(duì)樣品進(jìn)行染色，并用熒光顯微鏡（AXIOLAB HBO-500，蔡司）觀(guān)察。圖像是用PROGSPOT軟件拍攝的。細(xì)胞密度為 1,000 個(gè)細(xì)胞/孔或 50,000 個(gè)細(xì)胞/孔。

2.8 統(tǒng)計(jì)分析

使用社會(huì)科學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件包（SPSS）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于每個(gè)人群，通過(guò)Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)檢查組正態(tài)性。通過(guò)Levene檢驗(yàn)評(píng)估組間方差的同質(zhì)性，并進(jìn)行單因素方差分析以檢查均值之間的統(tǒng)計(jì)差異。最后，進(jìn)行了Tukey和Scheffe的事后測(cè)試。在所有統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)中，p < 0.05 被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)論

苯乙烯磺酸鈉成功接枝到PCL薄膜表面，磺酸鹽分布均勻。結(jié)果表明，該過(guò)程不會(huì)改變PCL薄膜的內(nèi)在特性，并產(chǎn)生一層薄薄的pNaSS覆蓋層，該層被發(fā)現(xiàn)是可靠和穩(wěn)健的，因?yàn)樗诜跤^(guò)程中是穩(wěn)定的。盡管pNaSS層的厚度很小，但PCL的生物活性得到了改善，因?yàn)樗话l(fā)現(xiàn)接種到嫁接的PCL薄膜上的成纖維細(xì)胞具有更好的粘附性，增強(qiáng)的擴(kuò)散和更高的代謝活性。pNaSS的接枝可以有效地調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)，似乎是開(kāi)發(fā)用于組織工程應(yīng)用的生物活性聚酯基支架的良好替代方案。例如，在使用結(jié)締組織工程的前交叉韌帶重建中，最近的研究集中在開(kāi)發(fā)可生物降解的結(jié)構(gòu)上，這些結(jié)構(gòu)可以允許功能性移植，同時(shí)增強(qiáng)宿主整合。根據(jù)本研究獲得的結(jié)果，基于pNaSS接枝的PCL纖維的生物活性和可生物降解的假韌帶可能是下一代合成韌帶。pNaSS接枝到PCL纖維上的研究目前正在進(jìn)行中。